下面的操作方法可以使約3~5分子的生物素與1分子的蛋白結合，對某些蛋白來說，生物素與蛋白的分子比可根據不同的生物素化要求進行調整。

1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸鹽緩沖液中，并計算溶解的毫摩爾數。如果蛋白含有不恰當的緩沖液（如Tris或者甘氨酸），可以通過在PBS中透析或濃縮的方法除去。計算：蛋白質量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白質的毫摩爾數。

2. 在打開之前，平衡生物素至室溫。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超純水中，加入足夠量濃度的生物素，一般對于10 mg/ml 蛋白來說超過12倍分子數，對于2 mg/ml 蛋白溶液應超過20倍，或者該試劑也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

3. 室溫30分鐘，或冰上放置2小時。

4. 用30 ml PBS預洗純化柱，上樣，加入與欲收集量相同的緩沖液，收集0.5 ml 或1 ml 于單獨的管中。

5. 以280 nm 的吸收值測定蛋白含量。

6. 生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入疊氮鈉、甘油等保存。

HABA法檢測生物素標記效果：

試劑配制：
1. PBS（100 mM 磷酸鹽，150 mM Nacl pH7.2）。
2. HABA/親和素溶液：10 mg 親和素、600 ul10 mM HABA于19.4 ml 的PBS中，該溶液的A500大約在0.9~1.3之間，溶液于4℃保存可穩定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可過濾后使用。

比色法檢測生物素/蛋白質摩爾質量比：
1. 吸取900 ul HABA/親和素溶液于1ml比色杯。
2. 測定該溶液在500 nm 處的吸收值并記錄為“A500 HABA/Avidin”。
3. 吸取100 ul 生物素標記的蛋白于杯中并測定500 nm 的吸光度值，記為A500 HABA/Avidin/Biotin （數值必須恒定15s 以上）如果A500 HABA/Avidin/Biotin的值不超過（≤）0.3，重新稀釋待測樣品并檢測。
注：計算結果時必須考慮稀釋度。
4. 計算Biotin/Protein摩爾比
①A=生物素化的蛋白毫摩爾濃度＝蛋白濃度（mg/ml）/蛋白的分子量
②B=500nm處的吸光度變化（△A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin）
③C=生物素的毫摩爾濃度=mmol Biotin/ml反應溶液=△A500/（34,000×光程）
④Biotin/Protein摩爾比=C?10?稀釋倍數/

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