雙抗夾心ELISA檢測食品中大腸桿菌O157-H7方法研究
ELISA *包被濃度確定
包被是 ELISA 實驗中關(guān)鍵的一步，如果濃度過低， 包被液中的蛋白質(zhì)不能*覆蓋固相載體表面，隨后加入的特異性抗體和酶標二抗就有可能直接被吸附到固相載體上，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測結(jié)果偏高；濃 度過高，蛋白質(zhì)分子的相互作用影響聚苯乙烯與蛋白質(zhì) 之間的吸附，以至在隨后的抗原抗體反應(yīng)、洗滌等步 驟中，部分抗原或與抗體結(jié)合釋放到洗滌液中被棄去， 或直接釋放到洗滌液中造成抗原的浪費，因此，在 ELISA 測定中首先要測定合適的包被濃度。
雙抗夾心 ELISA 的反應(yīng)時間
在保證 ELISA 有效檢測病原菌的前提下，快速、方 便也是雙抗夾心 ELISA 的必要條件。雙抗夾心 ELISA 從 加入待測抗原到得出結(jié)果，檢測大腸桿菌 O157:H7 共需 要 5h 左右，而間接 ELISA 則需要 7h(包被 37℃，2h)或 者 17h(包被 4℃guo夜)。本論文篩選出的雙抗夾心 ELISA 檢測大腸桿菌 O157:H7 省去封閉這一步驟。在間接 ELISA 測定抗原中，封閉一般是*的，因為包 被不同濃度抗原不一定可以*覆蓋固相載體表面，如 果不封閉，很可能使隨后加入的特異性抗體和酶標二抗 直接被吸附到固相載體上，產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測 結(jié)果偏高。但是對于雙抗體夾心 ELISA 來說，在包被 捕獲抗體時已經(jīng)使固相載體飽和，已經(jīng)沒有多余的吸附 力來吸附隨后加入的特異性抗體和酶標二抗，這都說明 了雙抗夾心 ELISA 有不需要封閉的可能，通過正交試驗 結(jié)果也證明不封閉可以達到理想實驗效果，而且還縮短 了整個檢測流程和時間，說明只要酶標記物是高活性的 并且操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意結(jié)果。雙抗夾心 ELISA 檢測法的特異性和靈敏性 抗原抗體的結(jié)合實際上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間，由于兩者在化學結(jié)構(gòu)和空 間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特 異性。但這種特異性并不是的，假使兩種化合物 有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可能出現(xiàn)交叉 反應(yīng)。本實驗以大腸桿菌 O157:H7 及其他菌株共 10 株作 為抗原用來檢測本方法的特異性，結(jié)果顯示大腸桿菌 O157:H7 呈明顯陽性反應(yīng)，其余各菌株均呈陰性反應(yīng)， 說明本方法對大腸桿菌 O157:H7 具有明顯的檢測特異 性，而對所測定的其它菌株無交叉反應(yīng)。
本論文所建立的雙抗夾心 ELISA 方法對純培養(yǎng)的 大腸桿菌 O157:H7 檢出限均105CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的雙抗夾心 ELISA 檢測大腸桿菌 O157:H7 的檢測限為 10 5 CFU/ml ，趙志晶和劉秀梅[7] 建立的雙抗夾心ELISA 檢測大腸桿菌 O157:H7 的檢測限為 104CFU/ml，兩 者均用單克隆抗體作為檢測抗體，而本方法使用 IgY 抗 體與兔多克隆抗體，制備相對比單克隆抗體簡單，對試 劑、成本要求也相對降低，其效果基本達到檢測要求。
結(jié) 論
本研究通過水稀釋法及硫酸銨鹽析法純化抗大腸桿 菌 O157:H7 IgY，10mg/ml 純化 IgY 的效價為 1:320。以 大腸桿菌 O157:H7 免疫新西蘭大耳白兔，獲得了抗大腸 桿菌 O157:H7 的多克隆抗體，效價可達 1:25600。確定 雙抗夾心 ELISA 檢測條件的正交實驗分析表明，捕獲抗 體于 37℃包被 2h、不封閉、與抗原于 37℃結(jié)合 2h、檢 測抗體濃度為 0.25mg/ml、與抗原于 37℃結(jié)合 1h 為* 條件。該方法穩(wěn)定性、重復性良好，對純培養(yǎng)菌液檢 出限為 105CFU/ml，具有良好的敏感性及特異性，為快 速檢測大腸桿菌 O157:H7 奠定堅實基礎(chǔ)。染菌食品在 EC 增菌液中培養(yǎng)后進行雙抗夾心 ELISA 檢測，含有 0.1～
1CFU/ml 大腸桿菌 O157:H7 的樣品在增菌 12h 后可以檢出 陽性反應(yīng)，含有 1～10CFU/ml 大腸桿菌 O157:H7 的樣品 在增菌 8h 后可以檢出陽性反應(yīng)，延長培養(yǎng)時間對于檢 測結(jié)果無意義。
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